TRIzol试剂是一种含有
异硫氰酸胍和酚的单相液,能迅破碎
细胞并制细胞释放出的核酸酶。可从多种生物样品中分离高质量总
核糖核酸或同时分离RNA、
脱氧核糖核酸和蛋白。
解耦联剂异硫酸胍是一类强力的
蛋白质变性剂,可溶解蛋白质,并使蛋白质二级结构消失,细胞结构降解,核蛋白解离。酚裂解细胞,使细胞中的蛋白质和
核酸解聚。酚还变性蛋白质,部分抑制RNA酶活性。
Trizol试剂是一种含有水
饱和酚,8-
羟基喹啉、
异硫氰酸胍,β-
2-巯基乙醇等成分的
混合物。其工作原理是首先通过
苯酚、
异硫氰酸胍裂解
细胞,异硫氰酸胍它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对
核糖核酸酶有强烈的变性作用,使细胞中的RNA释放;8-羟基啉、异硫氰酸胍、β-基乙醇等可以抑制RNA酶活性,保护RNA完整性。随后加入的
三氯甲烷则促使细胞裂解液分层,
脱氧核糖核酸、
蛋白质与苯酚结合后存在于下层的氯仿有机相,而
核糖核酸存在与上层的水相,从而实现RNA的分离与提取。上层水相中的RNA,经过
2-丙醇与
乙醇的多步沉淀与洗涤,去除盐杂质以及多余的水,得到纯化的RNA分子,最后使用琼脂糖凝胶电泳检测所提纯的总RNA浓度以及完整性用
核酸测定仪进行精确定量。
除了购买成品TRIzol试剂,也可以自己配置TRIzol溶液。在的
烧杯中加入25.77%的无RNase超纯水,然后依次加入22%的
异硫氰酸胍、1.54%的
柠檬酸钠溶液(pH≥7),2.32%的十二
烷基肌氨酸钠溶液(Sarcosy),4.40%的
醋酸钠溶液(pH≥4),混合均匀,最后加入44%的重蒸
苯酚,混合均匀。(注意:TRIzol需4℃低温保存,保质期约一年)。
TRIzol™试剂一般应用于实时
荧光定量PCR(qPCR),
反转录酶PCR(RT-PCR),cDNA文库构建,核酸酶保护测定,Northern 印迹,
克隆。
TRIzol™试剂可很好地处理少量组织(50–100mg)和
细胞(5×106)以及大量组织(≥1g)和细胞(\u003e107),且包含用于从人、动物、植物或细菌来源的样品中进行纯化的方案。TRIzol™试剂通过在样品均质化期间高效抑制RNase活性来维持
核糖核酸的完整性,同时破坏细胞并溶解细胞组分。TRIzol™试剂方法的简单性使其可同时处理大量样品。整个程序可在1小时内完成。通过TRIzol™试剂分离的总RNA不含蛋白和
脱氧核糖核酸污染。
TRIzol™试剂可以连续沉淀单份样品中的RNA、DNA和蛋白。使用TRIzol™试剂均质化样品后,加入
三氯甲烷,使匀浆分离成透明的上层水层(含RNA)、中间相和红色下层有机层(含DNA和蛋白)。使用
2-丙醇从水层中沉淀出
核糖核酸。使用
乙醇从中间相/有机层中沉淀出DNA。通过异丙醇沉淀从
苯酚乙醇上清液中沉淀出蛋白。洗涤沉淀出的
核糖核酸、DNA或蛋白以去除杂质,然后复溶以用于下游应用。
TRIzol对人体有害,使用时应戴一次性手套,注意防止溅出。如果接触到TRIzol试剂,需要立即使用大量
去垢剂和水冲洗。该试剂还含有酚类和疏基乙醇等成分,具有特殊气味,请于吸取试剂溶液后马上盖好瓶盖,或于通风橱中操作。
TRIzol™试剂是以Chomczyń
SKI与Sacchi在1987年提出的一步分离
核糖核酸法为基础发明的。Chomczy
日本精工将此方法申请了专利。(专利号4,843,155/5,346,994)
TRIzol为由生命科技(Life Technologies)持有的商标,由生命科技(Life Technologies)所生产的分离RNA、
脱氧核糖核酸、
蛋白质的试剂名为TRIzol试剂。生命科技公司于2014年1月被赛默飞(Thermo Fisher Scientific)收购
MRC,MRC生产的分离
核糖核酸、DNA、蛋白质的试剂名为TRI Reagent(Reagent,意为「试剂」)