小时聪颖好学，5岁能口诵“五经”章句数百句，10岁则援笔成文。13岁应童生试，名列第二。光绪二年（1876）乡试中式，光绪九年中
进士。先后任户部广东司
主事，户部则例馆修，顺天乡试内修掌官，
山东省、
陕西省、湖北、
河南道监察御史。1903年，徐定超以薪俸积蓄托其侄徐象严在家乡兴办枫林高等小学。1908年，他受聘任
浙江省两级师范学堂监督（即校长），锐意革新，废除旧敝。1912年，徐定超创办
永嘉县立第一高等小学（今广场路小学）。
为官清正、廉洁、勤俭、谨慎，有一定的维新思想和改革要求，曾向清廷疏陈时政得失利弊数十条。多次弹劾清廷亲贵权轩和贪官污吏，致使十来顶“花”落地。他的老师
黄体芳（兵部左侍郎、都察院右副
都御史）赞赏他“性慷爽，意所可否，质言无回”。教育家
蔡元培给徐定超纪念祠题的对联是“
御史楼台高百丈，谏官祠宇壮千秋”。
“
戊戌变法”前他已认识到“社会积弊太深”，主张开办学堂，造就人才；在“百日维新”中，一些顽固派指责
康有为、
梁启超“狂妄”，他反驳说：“国家改革，殷周当天”，把维新改革比作以周代殷，势所必然。对变法失败，特别对
谭嗣同等“六君子”及后来秋瑾的牺牲，深表痛惜，从而进一步认识到依靠满清皇朝的自身改革是不可能的。所以得知有人欲保荐他的儿子可免试出任县知事时，他给儿子的信中说“大局未定”，要“读书待时”，鼓励子女“多学历史、地理、技术等经世有用之业”，“不患儿等不能为官，唯患儿等不能为人”。在他的思想影响下，他的两个儿子分别参加了“光复会”和“同盟会”。
“
戊戌变法”失败后，1905－1906年，
袁世凯不顾江、浙两省自办苏一杭一甬铁路的要求，屈服于
英国公使馆的压力，以向英国高利贷款、起用英国工程师的先决条件，来建造这条铁路，实际上是把这条铁路控制权拱手送给英国人，从而引起江、浙各界的极大愤慨。他立即发动24人联名上书清廷，痛陈利害，并直接揭发袁世凯的卖国行径。同时江、浙各界通电川、陕、粤、鄂、赣、滇、闽各省，请求声援。结果得到全国各地的响应，酿成震撼全国的浙江拒款保路运动，迫使清廷中止这桩卖国行为。在此期间，他大量地阅读历代医学经典及名家流派著作，对医学颇有造诣，在北京医界名噪一时，被京师施药局聘为医员，就诊者接踵而至。1902年，清廷创办京师医学堂，他被聘为总教习，同时还被中医界推选为京师神州医药会社社长。他根据我国和
日本的中医名著，以及自己的临床实践，撰写了《伤寒论讲义》、《灵枢素问讲义》。前者完成于1906年，书中引用的各家注释达50多家，并且去粗存精，熔众说为一家。他在序言中主张理论要与实际相结合，提出中医和西医各有所长应相互学习的主张。
1909年，除定超受聘担任两浙师范学堂监督，起用
经亨颐（日本留学生，思想进步，后来是我省“五四”运动领导人之一）为教务长，聘用一批思想进步的学者为教员，其中有
鲁迅、马叙伦、
夏丏尊、
沈尹默、
胡公冕等。两浙师范学堂当时是
浙江省规模最大的一所新型学校，成为传播进步思想，培养人才的重要阵地。徐定超在这里当了3年的监督。从这所学校中培养出来的学生，有些后来成为国内外有名的学者，如
陈建功、
曹聚仁、
冯雪峰、
潘天寿、
谢文锦、宣中华、
丰子恺、徐麟书等。他还以自己的薪俸积蓄，托他侄儿徐象严在永嘉家乡创办了枫林高等小学。
辛亥革命胜利后，浙江宣告独立，
温州市的清朝官吏逃之夭夭，社会秩序一片混乱。温州各界推举徐定超来温主持军政分府
都督，由于再三电邀。他于1911年11月9日从
杭州市回到温州。温州父老子弟夹道相迎达数万人。徐定超到任后，励精图治，选贤任能，从政治上、经济上，组织上采取了一系列果断措施。对制止紊乱局面，减少群众疾苦，巩固革命成果，起了重要作用。
徐定超为清皇朝命宫，接受民主主义思想，参加同盟会，跟着历史车轮前进，这是难能可贵的。他渴望辛亥革命后
中原地区能出现一个新的局面。但是，事与愿违，不久窃国大盗袁世凯篡夺了革命果实，实行专制独裁，派其亲信
朱瑞任
浙江省督军。徐定超不愿与他们同流合污，于1912年秋，毅然辞掉温州军政分府的
都督职务，赴
杭州市从事《
浙江通志》编纂工作。1917年，他偕同夫人
胡姓经
上海市回
温州市，所乘的普济
轮船在吴淞江口被一艘
英国轮船撞沉，因而夫妻均遇难，终年73岁。