杜作祥1907年出生于归县
屈原镇长江村二组。小时家境富裕，其父先后任长沙都督府科员和武汉高等师范庶务主任等职。她自幼聪颖好学，在父亲任地就读小学和中学，民国14年（1925）以优异成绩考入湖北省立女子师范学校，民国16年春加入中国共产党，同年受党组织委派进入苏联中山大学学习，与张闻天、王稼祥、杨尚昆等同学3年。民国17年（1928）春，杜与陈昌浩（后曾任
中国工农红军第四军政治委员、西路军军政委员会主席等职）在莫斯科结婚。民国19年（1930年）冬，夫妻俩先后回国。次年4月，陈被派往鄂豫皖苏区，杜留在
上海市工作，任
中共上海中央局妇女部部长兼
中华全国总工会女工部部长。在白色恐怖面前，杜在党的领导下，采取各种方法进行地下革命活动。为完成党委交给的任务多次面临被捕危险，她机智摆脱特务追踪，化险为夷。民国22年（1933年），以博古为首的临时党中央离开上海，迁往
江西省，杜仍留上海并转入绝密机构，在上海驻地
苏联派出的军事专家指挥
中央革命根据地作战的来往密电翻译工作。次年6月，中共中央上海中央局遭到重大破坏，16名共产党人被捕。杜于9月间在上海法租界被捕，先被关押在法租界监狱，后押送到国民党上海警察局监狱，随后被押解到江苏南京“反省院”。她在两年的监狱生活中，虽屡受
醢刑及严审，始终没有出卖同志，没有写自首书，也没有写反共宣言。直至民国25年（1936年）9月释放后，她没有找到党的组织，就在
浙江省电话局当了一段时间雇员。之后又在汉口量才图书馆工作，并参加党的外围组织所进行的抗日救亡活动。民国27年（1938年）春夏，她几次到汉口八路军办事处汇报自己的情况并要求工作，但未得到明确的答复和安排。
武汉市沦陷后，她被迫回到
秭归县，在香溪小学任教员，暑假期间参加当地共产党组织领导的秭归县中小学教师抗日宣传团，到各乡镇宣传抗日，引起国民党县党部的不安，被勒令离开秭归，限期出境。此后，她辗转
重庆市、南京、
杭州市等地谋生，直至解放。在此期间，她参加党的外围组织作了不少有益的工作。虽不断寻找党组织，但组织关系一直没有得到恢复，使其脱党多年。
中华人民共和国成立后，杜曾在杭州公路工程处、
浙江医药公司、
浙江省税务局等单位工作过，后被调入杭州工业学校、商业纺织学校教授俄文。1965年，她在杭州化工学校（现浙江工学院）退休。1967年，“
四人帮”的爪牙为让她“揭发”曾留苏的某中央首长的“罪行”，把她押解至北京近郊监狱，受尽凌辱和非人折磨。1982年11月，中共
浙江工商大学杭州商学院对杜的政治历史问题作出复查结论，决定撤销1957年对她所作的“叛党分子”的错误结论，恢复其党籍。1995年间，杜作祥与她的随行人员回来看望老家和亲人，住宿多日。1985年6月，经批准，由离休改为退休。1997年2月11日，杜在
杭州市病故。遵照她的遗愿，骨灰撒于
钱塘江，流入大海。