磷酸键是一种化学基团，是核酸分子中相邻核苷酸之间的连键，是指两个核酸分子核苷酸残基的两个羟基分别与同一磷酸基团形成的共价连接键，它是连接两个核苷酸的桥梁。磷酸二酯键能通过三氯氧磷法、DCC（二环己基碳二亚胺）法和芳香磺酰氯法合成，能够在酸、碱和酶的作用下发生水解反应。

芳香磺氯是合成磷酸二键的常用方法，常使用的芳香磺酰氯是 2,4,6-三磺酰氯和2,4,6-三磺酰氯，具体反应过程如下图所示。

在比较温和条件下，核苷与磷酰氯反应，主要生成 5'- 磷酸核苷。如果5'-OH已经被保护，则 3'-OH 也可以发生磷酰化，生成核苷3'-三氯氧磷。核苷-3'-磷酰氯具有较强的磷酰化能力，可以与另一分子核的5'-OH作用，生成磷酸二酯键。此法产率低，副反应多，很少使用。

DCC与3'-磷酸核苷的3-P-OH反应形成类似酸酐的活性中间体从而达到活化目的。此法反应速率慢，伴随副反应较多，因此在实际合成中很少应用。下面是应用 DCC作为偶联剂形成磷酸二酯键的反应：

脱氧核糖核酸和核糖核酸中的磷酸二酯键都能被酸、碱和酶水解。

磷酸二酯键能被酸水解，用中等强度的酸在100℃下处理数小时，或用2~6mol/L HCI处理，则可使磷酸二酯键断裂，发生酸水解反应。

RNA的磷酸二酯键易被碱水解，产生核苷酸。DNA 的磷酸二酯键则不宜被碱水解。这是因为 DNA 的脱氧核糖无2'-OH 基，不能形成碱水解的中间产物，故对碱有一定抵抗性。

催化核酸中磷酸二酯键水解的酶统称为核酸酶。胞内存在许多不同的核酸酶，有些核酸酶是脱氧核糖核酸合成和修复所需要的，而另一些酶则是用于细胞内核糖核酸的生产和降解的。核糖核酸酶（ribonucleases，RNases）只作用于RNA，而脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclesases，DNases）只作用于DNA。但有些核酸酶既催化RNA水解，也催化DNA水解。像蛋白酶一样，核酸酶可以根据酶作用的部位不同分为外切核酸酶和内切核酸酶。外切核酸酶水解磷酸二酯键后，从多核苷酸链的末端释放核苷酸残基；而内切核酸酶可以在多核酸链内的不同位置水解磷酸二酯键。水解时，既可以在3',5'-磷酸二酯键的3'-酯键处，也可以在5'-酯键处切断磷酸二酯键。一种类型的水解可以产生5'-单磷酸和一个3'-羟基，而另一种水解方式可以产生3'-单磷酸和5'-羟基。