基因导入是指将已知
基因转移到
真核生物中,并使其在
基因组中稳定表达的技术。这是改变物种遗传性状的基本手段之一。基因导入通常先将目标细胞克隆化,然后使用显微操作将特定基因注入受体生物的
受精卵原核生物中,随后将受精卵植入生殖管道,发育成的个体既能表达注入基因所决定的性状,也能将该基因传递给后代。
基因导入的成功案例包括“超级
小鼠”的培育。这些小鼠生长迅速,74天时的体重几乎达到同窝正常小鼠的两倍。这项成就不仅为遗传工程和研究遗传性疾病(如
巨人症)提供了模型,还为促进
经济动物快速生长开辟了新路径。
这种方法涉及将目的基因包裹在金属颗粒中,然后利用高压发射装置加速金属颗粒进入
细胞,从而显著提高肿瘤细胞的转化率。
脂质体载体方法具有安全性高、操作简便、毒性低、无免疫原性等特点,适合于注射方式进行器官特异性转移,并具有一定的转移效率。除了病毒载体转移方法,脂质体载体也是体内
基因转移的有价值选择。常用于体外转化细胞,或通过瘤组织内注射进行体内转化,并已有少量临床应用报道。常用的脂质体产品为Lipofectin,它可以自发地与
脱氧核糖核酸形成
配位化合物,保护外源DNA免受核酸酶降解,具有制备简单、安全无毒、无免疫原性、重复性、对基因片段大小无限制且转染操作方便等优点。由于可以直接与细胞膜融合,能有效避免溶酶体破坏,因此转染效率较高。然而,脂质体的靶向性有限。Nishikawa等人通过尾静脉注射含有
荧光素酶基因的
质粒DNA-脂质体复合物,发现在肺、肝、脾等多个器官组织中有荧光素酶基因及其产物的持续表达,超过三个月。常规脂质体容易被网状内皮系统(RES)细胞摄取,在巨噬细胞本身就是靶细胞的位置,RES的这种亲和力是有益的。Hasegawa等人使用
日本血凝病毒(hemagglutinating
病毒 of Japan,HVJ)脂质体作为载体,使用HSV-tk/Gcv系统治疗
肝癌,发现在体外试验中,当Gcv浓度为100μg/mL时,几乎所有肿瘤都被杀死,即使转导率为20%,也有三分之一的肿瘤被消灭。重复使用效果更好,皮下注射未观察到明显炎症反应。
这种方法利用肝细胞表面丰富的转移因子和糖蛋白受体,人工合成多聚阳离子氨基酸,然后连接转移因子(或糖蛋白)和目的基因,形成
配位化合物,通过与肝细胞表面受体结合来实现目的基因的转移。这种方法具有良好的靶向性,但由于受体介导的内吞小泡会被转运至溶酶体,易被溶酶体降解,导致目的基因表达时间短,表达效率低。可以通过使用氯喹抑制溶酶体酶或
腺病毒科与内吞小泡融合来破坏它们,释放外源
脱氧核糖核酸,从而提高转化效率。
逆转录病毒构建简单,能够容纳的最大外源基因容量可达8kb,整合到宿主
细胞基因组中而不产生病毒蛋白表达。但它只能感染
分裂期细胞,体外制备滴度较低,且随机整合可能导致“插入性突变”。
腺病毒是近年来肝细胞
肝癌基因治疗中最常见的病毒载体之一。体外制备滴度较大,能够容纳的最大外源基因容量可达35kb,不会整合到宿主细胞基因组中,因此避免了插入突变的风险,能够感染分裂细胞和非分裂细胞。但是,易引发宿主免疫反应,导致转染效率下降,大剂量静脉给药可能会导致严重的肝脏炎症反应,因此全身给药受到限制。Nagao等人发现瘤内注射重组
腺病毒科后,目的基因能够有效表达,但表达时间短暂,重复注射后表达效率降低,并诱发
体液和
细胞免疫反应。
单纯疱疹病毒(herpes simplex
病毒,HSV)对非分裂细胞具有天然亲和力,能够容纳的最大外源基因容量可达30kb,体外制备滴度接近腺病毒。但在构建过程中难以去除与裂解细胞相关的基因,因此对细胞毒性较大。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)对人体无致病性,能够感染非分裂S相细胞,还能将基因转入非周期(noncyling)肿瘤细胞。AAV是一种缺陷前病毒,可用于携带
外源性重组
基因组,已应用于肝和
肝癌细胞的治疗
基因转移。
痘苗病毒(vaccinia
病毒)能够在细胞内部独立复制和
转录,并能以强效方式表达多种
肿瘤抗原。
杆状病毒(bacul virus)能够感染肝细胞和
肝肿瘤细胞,并能增强肝细胞肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素-1α(IL-1α)、白介素-1β(IL-1β)的表达。