聚合酶链式反应（聚合酶 chain reaction，简称：PCR），又称为基因体外扩增法，是由美国鲸鱼座（Cetus）集团凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis）博士于20世纪80年代中期发明的一种新型分子生物学技术，它可以利用DNA聚合酶的特性，在体外模仿生物体内DNA复制过程。因该技术具有高效、灵敏，易于操作及高特异性等特点，已在传染病及遗传病的诊断，生物医学，分子生物学方面得到了广泛的应用。

PCR技术在进行扩增的过程中主要包括以下三个步骤：变性、退火、延伸。自应用以来，其不仅成为分子生物学中的关键技术，也渐渐成为一项常规技术。自上世纪80年代中问世以来，该技术从只能单纯扩增已知序列DNA片段，发展到应用于各个领域的几十种PCR研究方法，检测得效率和自动化程度都在不断提高。但此技术仍有待改进之处，如进一步提高检测的特异性、准确性和敏感性、减少试验过程中的污染、减少实际应用的成本投入等。

1993年10月，PCR技术的发明者凯利·穆利斯博士成为当年瑞典皇家科学研究院颁发的诺贝尔化学奖得主之一，当时该技术被称为“具有里程碑式意义的分子生物学技术”，并被业内列为90年代生物技术10大热点之首。随着生物学技术不断发展，该技术被广泛运用到基因研究、医学领域、社会应用等方面，诸如基因图谱建立、基因突变研究、临床检测、刑侦法医、亲子鉴定等。

1985年由穆利斯（Mullis）博士首先提出了PCR技术（聚合酶 Chain Reaction），即聚合酶链式反应，又称为无细胞克隆技术，是一种对特定的序列DNA片段在体外进行快速检测的新方法。瑞典皇家科学研究院于1993年10月13日向全世界宣布，穆利斯博士为1993年诺贝尔化学奖得主之一。PCR技术被称为具有里程碑式意义的分子生物学技术，并被列为90年代生物技术10大热点之首。PCR技术的产生依赖于一系列成果产生：Arthur Kornberg于1955年首次发现DNA聚合酶，该酶于1958年首次被纯化成功；1955年-1970年间，科学家发现了DNA退火及引物沿5‘-3’方向延伸的热动力学过程；Kjell Kleppe博士首次完成了PCR实验，并提出了体外进行DNA复制的可能性；1971年Har Gobind Khorana首次提出扩增合成DNA的观点，系统地阐述了PCR理论。热稳定DNA聚合酶的成功提取满足了PCR变性时的高温条件，该酶高温条件下依旧保持活性，使得PCR反应得以自动化，具备多次进行循环的条件，因此PCR技术得到了突破性发展。机械物理学的高度发展，人们普遍采用DNA热循环仪或自动化PCR仪进行操作，技术结构的改善推动了PCR技术发展。

PCR技术发展的趋势显示了如下特点：定量水平由粗略定量，半定量向精确定量，绝对定量的方向发展；在定量时，参照物选择由简单的外参照向多个参照定量演变；检测手段已由样本终点检测向扩增动态连续检测，并定量的方向发展；检测方法已从手工，半自动步枪向成套设备的方向发展，而且检测得效率和自动化程度都在不断提高。

PCR方法也有很多有待改进的地方，如进一步提高检测的特异性、准确性和敏感性、减少试验过程中的污染、减少实际应用的成本投入等。PCR诊断方法的准确性与靶基因的选择密不可分，现核糖体基因、线粒体基因、编码蛋白基因以及其他特有的高拷贝数基因已被广泛应用于寄生虫病的PCR检测，但不同的寄生虫病所适用的靶基因不同，而随着组学技术的发展，可挖掘更多的靶基因来提高PCR技术的准确性，因此未来还需要更多的研究来确定检测各类寄生虫的最优特异性靶基因。

PCR技术的原理: DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡聚核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，脱氧核糖核酸聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3' -OH末端，并以此为起始点，沿模板5→3°方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括模板DNA (待扩增DNA)、引物、4种脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。DNA聚合酶和适宜的缓冲液。

PCR技术为特异性DNA体外扩增提供了一种十分简便，快捷的新途径，利用PCR技术能够在几个小时（2-4小时）之内将单个脱氧核糖核酸扩增106倍以上，实现可供检测或者试验操作的用量。其原理及反应步骤如下：最初利用人工合成两个约20bp的片段核苷酸作为引物，使其与待扩增脱氧核糖核酸片段的两端序列互补。接着，将引物掺入DNA片段中，随后进行加热变性处理，之后进行退火处理，在引物与DNA模板互补杂交后，再加入4种dNTP和DNA聚合酶进行扩增反应，由此完成PCR反应的第一轮循环。最后继续进行加热变性和退火操作，利用第一轮循环中扩增的DNA链作为模板进行下一轮扩增循环。

一般包括以下7个组分：模板、一对寡聚核苷酸引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、缓冲液、二价阳离子和一价阳离子。

变性是指通过升温使目标脱氧核糖核酸双螺旋的氢键断裂，形成作为反应模板的单链DNA。脱氧核糖核酸的变性温度会随G+C含量的增加而增加。若模板脱氧核糖核酸含有更多的G+C，其解链温度将会更高。另外，变性时间则与模板DNA的长度有关，DNA分子越长，则解链所需时间越长。

退火就是当反应体系冷却到一定温度后引物和DNA模板互补组合生成模板-引物配位化合物。当退火温度过高时，引物与模板的结合不理想，扩增效率将下降；退火温度过低会使引物非特异性地结合模板脱氧核糖核酸而形成非特异性DNA片段。最适的退火温度需要通过预实验来确定，一般比理论计算出引物和模板的熔解温度（Tm）低3℃-5℃。

延伸即将反应体系的温度提高到热稳定脱氧核糖核酸聚合酶的最适温度并持续一段时间。一般TaqDNA聚合酶的最适温度范围为72℃-78℃，在热稳定DNA聚合酶的作用下，以引物为起点，以四种单核苷酸为底物合成新的DNA链。在延伸后，单链模板DNA又形成了新的双链。

耐热性脱氧核糖核酸聚合酶（Taq酶）的发现，使得PCR技术开始应用于临床诊断。目前有两种Taq酶供应：一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠杆菌合成的基因工程酶。Taq酶浓度过高会引起非特异性扩增，若浓度太低则产物合常量过少。

模板的纯度一般不要求很高，不需要达到超纯级。但脱氧核糖核酸溶液中不能有影响扩增反应的物质存在，例如蛋白酶、核酸酶、结合DNA的蛋白质等，另一类是尿素、k12、卟啉类物质等，还有一类是二价金属离子的络合剂(如乙二胺四乙酸二钠）等会与镁离子络合，影响TaqDNA聚合酶的活性。模板脱氧核糖核酸的量一般对于单拷贝的哺乳纲基因组模板来说，100微升的反应体系中有100纳克的模板就足够，有时候模板太多会使得扩增失败。

dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以1M 氢氧化钠或IM 三羟甲基氨基甲烷 HCI的缓冲液将其pH调节到7.0~7.5，小量分装，- 20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应体系中，dNTP量为50 ~ 200 μmol/L，尤其是要注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其他几种时(偏高或偏低)，就会发生错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP 会络合溶液中的Mg2+，而且大于200 μmol/L的dNTP会增加TaqDNA聚合酶的错配率。如果dNTP的浓度达到1 mmol/L时，则会抑制Taq DNA聚合酶活性。

镁离子浓度对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响。镁离子浓度太低会无PCR产物，太高又会导致非特异性产物产生。故需要根据各自的预先实验，以确定本实验的最佳浓度，保证Taq DNA聚合酶具有良好的活性。

引物是PCR特异性反应的关键。PCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡聚核苷酸链作为引物，通过PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

引物的设计应遵循以下原则:

(1)引物长度: 15 ~ 30 bp，常用为20 bp左右。

(2)引物扩增片段长度：以200 ~ 500 bp为宜，特定条件下可扩增长至10 kb的片段。

(3)引物碱基: GC含量以40% -60%为宜，GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

(4)避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

PCR反应缓冲溶液通常用10 mmol/L Tris . HCI(pH8.3, 20 ℃)，它是两性离子中和剂。此外，还有50 mmol/L 氯化钾，它有利于引物与模板退火。高于50 mmol/L的氯化钾，或50 mmol/L的NaCl对Taq酶有抵制作用。明胶或血清白蛋白(100 ug/ml)及非离子去污剂，如Tween20等，对Taq酶起稳定作用。

1、高度灵敏性：PCR技术可以对极微量脱氧核糖核酸进行检测和分析，Mullis等人采用PCR诊断镰性细胞贫血症，实验结果显示PCR检测的灵敏度比Southern印迹杂交实验高出100倍。

2、高度特异性：使用TaqDNA聚合酶时，PCR产物的特异性很高，其碱基错配率只有10-4左右。

3、快速简便和适用面广：PCR技术被广泛用于临床诊断及基础分子生物学研究中，如遗传病产前诊断；从应用的方法来看，它既可以单独使用，也可以与cDNA探针技术配合使用；从应用的范围来看，凡是涉及微量脱氧核糖核酸鉴定、检测和操作，都可以使用PCR技术；从应用对象来看，它既可以用于DNA微量检测，也可以用于核糖核酸的扩增和检测。

在PCR反应的过程中进行一定的修改即能产生不同的作用，因此关于PCR技术的延伸方向也极为多样化，目前对PCR延伸技术主要分为以下几类：

原位PCR（in situ PCR）就是在细胞或组织切片上进行PCR反应，它聚集了具有细胞定位能力的原位杂交特点和高度特异灵敏的PCR技术的优点，在分子和细胞水平检测特定的基因序列、转基因及外源基因，对于研究疾病发病机理和临床过程具有重大意义。原位PCR可以分为间接法和直接法。间接法是在固定组织或者细胞标本并用蛋白酶消化处理后，先通过PCR扩展靶细胞内特定的核苷酸序列的检测及细胞内定位。直接法是在原位PCR进行前，在PCR反应液中加入标记好的核酸，随着扩增的进行，标记物会直接掺入到PCR反应物中，随后使用放射自显影、免疫组化或荧光检测技术对核酸分子进行细胞内定位检测。间接法相对来说结果更加可靠，特异性强，但步骤稍微繁琐；直接法有较高假阳性概率。

不对称聚合酶链式反应是指在聚合酶链式反应中使用两种不同浓度的引物，经过几个循环后，低浓度的引物被耗尽，随后的循环只产生高浓度的引物延伸产物，从而产生大量特定长度的单链DNA。用这种方法产生的单链脱氧核糖核酸可用做杂交探针或DNA测序的模板。不对称PCR一般产率较低，不对称PCR产量随引物比率的不同而变化，而且反应中模板脱氧核糖核酸量决定了循环次数。

逆转录-PCR（Reverse transcription-聚合酶 chain reaction，简称RT-PCR）是用组织或细胞内的mRNA为模板，利用寡核苷酸(dT)或者随机引物，通过利用逆转录酶逆向合成cDNA，然后使用cDNA为模板链进行PCR扩增得到目的基因或检测基因表达。该技术主要用于基因转录物的分析，靶基因的获取，cDNA探针的合成，或RNA高效转录系统的构建。

反向PCR（inverse PCR，IPCR）是将侧翼区脱氧核糖核酸转变为引物内围区域，用合适的限制性内切酶在已知DNA序列之外切割‚再将形成的限制性DNA片段连接成环状分子。所用的引物和已知序列两端顺序同源。不同的是它们的 3’端方向转向侧翼区的未知DNA序列。经过一般的PCR扩增之后，其产物就是该环状分子中未知序列的DNA片段。也可以将环化DNA线性化后再进行PCR扩增。反向PCR在研究转位因子、反转录病毒以及所有可以整合或转位到基因组中的其他DNA序列等方面都能取得良好效果。

定量PCR是指一种标准物为对照，通过对PCR最终产物的分析、PCR过程的检测或对PCR起始模板量进行定量的技术。目前主要利用的定量PCR方法有极限稀释法、设定内参照物的定量PCR以及荧光定量PCR（flurescence quantity PCR，FQ-PCR）等。定量PCR是在PCR技术基础上改进的一种高灵敏度核酸定量技术。与传统的PCR相比较，定量PCR能够更加快捷、灵敏，并高效地对核酸进行定量检测。

多重PCR（multiple PCR）又称多重引物PCR或复合PCR，是在同一PCR反应体系中加入两对或两对以上引物，同时扩增多个核苷酸片段的PCR反应。其反应原理、试剂、操作过程与普通PCR实验相同。在核酸诊断的许多领域，包括基因敲除、突变、多态性分析、定量分析以及核糖核酸检测等方面有众多应用。

巢式PCR是PCR的一种改进形式，它由两轮PCR扩增和两组引物对的使用组成。步骤一，首先扩增目标脱氧核糖核酸；步骤二，从第一步反应产物中提取少量产物，作为第二步扩增的反应模板。第二PCR引物与第一反应产物的序列互补，第二PCR扩增的产物为目标产物。巢式PCR大多应用在当模板DNA含量较低且一次PCR难以获得满意的结果时，用巢式PCR技术的两轮扩增就可以获得很好的效果。

锚定PCR（anchored PCR，A-PCR）是在基因未知序列端添加同聚物尾，人为赋予未知基因末端序列信息，用人工合成的与多聚尾互补的引物作为锚定引物，在与基因另一侧配对的特异引物参与下，对同聚物尾的序列进行扩增。锚定PCR可克服未知序列带来的障碍，对分析未知序列基因有特殊价值。另外，当已知某蛋白氨基端或羧基端序列时，锚定PCR还可以用于从基因组脱氧核糖核酸克隆该蛋白质基因。

免疫PCR是一种新开发的灵敏性和特异性较强的抗原检测系统，它利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏度来检测抗原，尤其适用于极微量抗原检测，免疫PCR的主要优势在于特异性较强、灵敏度高以及操作简单等。

将两个不相邻的脱氧核糖核酸片段重组在一起的聚合酶链反应称为重组聚合酶链反应。基因表达调控是分子生物学研究的重要内容之一。为了研究基因结构与表达的关系，有必要构建基因缺失、插入、点突变等一系列突变体。有时需要将两个不同的基因融合在一起以产生重组体，利用重组PCR构建突变体和重组体是一种非常有效的方法。

第一代传统PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，但该方法主要适用于定性和半定量研究。20世纪90年代初，第二代定量PCR技术问世（qPCR），尽管经过十几年的迅速发展，qPCR技术已经达到快速、简易和经济的特点，但是qPCR所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR的准确度和重复性依然不能满足分子生物学定量分析和临床精确的诊断，在这种背景下，第三代PCR-数字PCR（digital PCR，dPCR）应运而生。与qPCR不同的是，数字PCR可以不需要对照标准样本制作标准曲线实现绝对定量。

如基因图谱建立、基因表达、脱氧核糖核酸遗传、复制特定基因、基因突变研究、远古DNA分析等。

如病毒感染、疾病检测、遗传病研究、胎儿早期检测等。过去对病毒感染的临床检测多采用病毒培养、电镜观察和血清学等手段，但是诊断周期长，灵敏度不高。通过PCR技术的应用，尚未形成病毒颗粒的单个DNA分子可以迅速扩增到可用于诊断的水平，从而显著提高了灵敏度并缩短了诊断的时间。应用PCR技术从基因水平上诊断癌症已经在世界范围内获得成功。应用PCR技术可以快速、简便且安全地进行遗传性疾病的胎儿期诊断。

如刑侦法医、亲子鉴定等。因为犯罪现场经常留下头发和血迹，但数量极少，用普通方法无法检测。利用技术从剩余的极少量脱氧核糖核酸片段中扩增出大量的DNA片段，就可以检测到。用PCR技术扩增y染色体特定DNA区域149 bp的DNA片段和Alu重复序列300 bp的DNA片段。通过比较这些引物在不同性别间所产生的特异性条带，来判断其是否为雌雄性别的标记。若在PCR产物中检测到两条长度为149bp和300bp的条带，则该产物为雄性；反之，若PCR产物中仅出现一条长度为300bp的条带，则该产物为雌性。

PCR作为一项具有革命性的技术，不仅在推动遗传和分子生物学技术的发展方面发挥了重要作用，同时也在不断地与该领域的核心技术进行融合和创新。PCR技术在分子生物学、临床医学、考古学等各个领域都取得了巨大的成就。

美国当地时间2019年8月7日，博士凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis）因肺炎去世，享年74岁。《纽约时报》曾评价穆利斯的成就，“高度创新，非常重要，将生物学划分为了两个时代：PCR前时代和PCR后时代。”