《分子生物学实验技术》是一本于2008年1月1日由化学工业出版社出版的图书，作者为屈伸和刘志国。

作为一本实验技术类专著，本书不仅较详细地阐述了有关技术的具体操作和程序，更着力于对各种技术的基本原理及其相关理论基础进行深层次的剖析。

故本书不仅可作为从事生命科学，特别是分子生物学相关领域工作者的实验室必备参考工具书，同时也可供高校相关专业师生及科学工作者对分子生物学实验技术的理论做深入探讨时参考。

本书是关于分子生物学实验技术的一部综合性著作。它全面覆盖了有关分子生物学实验技术的诸多领域，包含了生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术等。

第一章 生物大分子制备和分析常用技术

第一节 概论

一、预处理和细胞的分离

（一）选择材料及预处理

（二）细胞的分离

二、细胞的破碎及细胞器的分离

第二节 电泳技术

一、基本原理

二、影响电泳的因素

三、醋酸纤维素薄膜电泳

四、琼脂糖凝胶电泳

（一）核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系

（二）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系

（三）琼脂糖凝胶电泳基本方法

五、常规聚丙烯胺凝胶电泳

（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

（三）操作方法

六、SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

七、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳

八、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳

（一）等电聚焦的原理

（二）pH梯度的形成

九、双向凝胶电泳

十、染色方法

（一）蛋白质染色

（二）核酸染色

第三节 色谱技术

一、色谱技术的概念

二、色谱法的分类

（一）按两相所处的状态分类

（二）按色谱的分离机制分类

三、常用的色谱方法

（一）凝胶色谱

（二）离子交换色谱

（三）亲和色谱

（四）高效液相色谱

（五）毛细管电泳

第四节 离心技术

一、离心理论

（一）离心分离的原理

（二）相对离心力和离心时间

（三）离心机的分类

二、离心分离的种类

（一）差速离心法

（二）密度梯度离心法

三、离心操作注意事项

第五节 分光光度技术

一、基本原理——朗伯？比尔定律

二、分光光度技术的应用

（一）定量分析

（二）定性分析

第二章 蛋白质、核酸的提取与分离

第一节 蛋白质的提取、分离纯化及定量

一、蛋白质（包括酶）的提取

（一）水溶液提取法

（二）有机溶剂提取法

二、蛋白质的分离纯化

（一）根据蛋白质溶解度不同进行分离的方法

（二）利用色谱技术对蛋白质进行分离纯化

（三）利用电泳技术对蛋白质进行纯化分离

（四）利用超速离心分离制备蛋白质

（五）膜分离技术在蛋白质分离纯化中的应用

（六）重组蛋白的分离纯化

（七）分离制备蛋白质的一个实例

三、蛋白质的定量

第二节 脱氧核糖核酸的提取与分离

一、质粒DNA的提取与分离

（一）质粒提取的一般步骤

（二）质粒DNA的小量制备

（三）质粒DNA的大量制备

二、染色体DNA的提取与分离

(一)从培养细胞中提取DNA

(二)从组织中提取DNA

(三)从大量血样的白细胞中分离高分子量DNA

(四)从小量血样的白细胞中分离高分子量DNA

(五)高分子量DNA的小量快速制备

第三节 核糖核酸的提取与分离

一、组织培养细胞胞质RNA的制备

二、胍盐法制备总RNA

(一)氯化纯化培养细胞的RNA

(二)氯化铯纯化组织中的RNA

(三)一步法从培养细胞或组织中分离RNA

三、细菌RNA的制备

(一)从革兰阴性菌中分离高质量RNA

(二)革兰阳性菌RNA的分离

(三)革兰阴性菌RNA的快速分离

四、poly(A)+RNA的制备

第四节 核酸的定量测定

一、紫外分光光度法测定脱氧核糖核酸和RNA的含量

二、电泳比较法（溴化乙锭荧光法）

三、定磷法测定核酸

四、二苯胺法测定DNA含量

五、地衣酚法测定核糖核酸含量

第三章PCR技术77

第一节PCR技术基础77

一、基本原理77

（一）反应过程77

（二）产物类型78

（三）平台效应78

二、PCR技术的特点79

三、标准PCR反应79

四、影响因素80

(一)模板80

(二)引物81

(三)循环参数82

(四)Taq DNA聚合酶及其浓度83

(五)Mg2+浓度83

(六)dNTP浓度83

(七)其他辅助试剂84

五、扩增产物的检测分析84

（一）琼脂糖凝胶电泳84

（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳85

（三）核酸探针杂交鉴定法85

（四）限制性内切酶分析法85

（五）单链构型多态性分析法86

六、PCR条件优化86

(一)常规的优化方法86

(二)降落PCR86

七、PCR常见问题与对策87

（一）PCR污染87

（二）污染的预防87

(三)实验中的对照87

(四)扩增反应总是阴性结果(无产物)时应采取的措施87

(五)出现非特异性产物时应采取的措施88

第二节PCR技术的扩展88

一、逆转录PCR88

二、定量PCR89

（一）利用参照物的定量方法89

（二）竞争性定量PCR89

（三）荧光定量 PCR90

三、重组PCR91

四、反向PCR92

五、不对称PCR92

六、复合PCR92

七、着色互补PCR 93

八、锚定PCR93

九、原位PCR93

十、膜结合PCR93

十一、固着PCR93

十二、增效PCR94

第三节PCR技术的应用94

一、PCR技术在分子生物学中的应用94

二、PCR技术在传染病病原体检测中的应用95

三、PCR在肿瘤相关基因检测中的应用96

四、 PCR技术在遗传病早期诊断中的应用97

五、PCR在骨髓移植HLAD位点配型中的应用98

六、 PCR技术在法医学鉴定中的应用98

七、 PCR在进化分析中的应用99

第四章分子杂交与印迹技术100

第一节核酸杂交的基本理论100

一、 脱氧核糖核酸变性、复性及杂交100

二、核酸探针101

三、核酸杂交方法102

（一）影响杂交的因素102

（二）固相杂交法103

(三)液相杂交法 104

（四）杂交信号的检测107

第二节常用印迹杂交方法107

一、 Southern印迹杂交法107

二、 Northern印迹杂交法111

三、斑点及狭缝印迹杂交113

四、菌落原位杂交法 113

五、核酸原位杂交法115

（一）组织与细胞的固定115

（二）载片和组织切片的处理115

（三）杂交116

（四）杂交后处理118

（五）显示119

（六）对照实验和核酸原位杂交结果的判断119

六、 Western印迹杂交法120

（一）蛋白质的分离120

（二）转膜120

（三）鉴定用膜的准备121

（四）鉴定122

第五章分子克隆技术123

第一节概述123

一、分子克隆的基本步骤123

二、分子克隆研究的内容124

（一）分子克隆工具的研究124

（二）分子克隆技术的研究124

（三）克隆对象——目的基因的研究124

（四）分子克隆产品的研究124

第二节克隆操作中需要的工具酶125

一、限制性核酸内切酶125

（一）限制性核酸内切酶的类别126

（二）同工异源酶与同尾酶127

（三）限制性核酸内切酶活性及其影响因素128

二、 脱氧核糖核酸连接酶128

三、 DNA聚合酶129

（一）DNA聚合酶Ⅰ129

（二）Klenow酶129

（三）Taq DNA聚合酶129

（四）反转录酶130

（五）T4 DNA聚合酶130

（六）T7 DNA聚合酶131

四、修饰酶131

（一）碱性磷酸酶131

（二）末端转移酶132

（三）T4多核苷酸激酶132

（四）S1核酸酶132

第三节基因克隆载体133

一、质粒载体133

二、噬菌体载体135

三、黏粒载体137

第四节基因克隆的一般方法137

一、获得目的基因的常用方法137

（一）化学合成法137

（二）逆转录PCR克隆目的基因138

（三）PCR方法克隆目的基因139

（四）利用基因表达差异的克隆方法139

二、目的基因与载体连接141

（一）具黏性末端的脱氧核糖核酸片段之间的连接141

（二）平末端的连接142

三、构建文库克隆目的基因143

（一）构建cDNA文库克隆目的基因143

（二）构建基因组文库克隆目的基因147

四、利用差异文库的克隆方法150

（一）差别杂交和扣除杂交克隆的目的基因150

（二）代表性差别分析技术克隆目的基因151

（三）抑制性扣除杂交技术153

第五节克隆筛选与鉴定155

一、重组DNA导入受体细胞155

二、重组体的筛选与鉴定156

（一）根据遗传表型的筛选方法156

(二)依赖重组子结构特征的筛选法158

第六章外源基因转移技术160

第一节外源基因导入原核生物的常用方法160

一、自然条件下的转化现象160

二、受体细胞的选择161

三、转化方法162

（一）氯化钙诱导大肠杆菌转化法162

（二）电穿孔驱动的完整细胞转化164

（三）聚乙二醇介导的细菌原生质体转化164

（四）通过接合作用传递质粒脱氧核糖核酸165

（五）λ噬菌体的转导和转染165

四、转化率及其影响因素166

第二节外源基因导入真核生物的方法167

一、物理方法168

二、化学方法170

三、生理方法174

第三节病毒载体介导的基因转移175

一、核糖核酸病毒载体及其介导的基因转移175

（一）逆转录病毒175

（二）逆转录病毒载体176

二、DNA病毒载体及其介导的基因转移179

(一)腺病毒载体179

(二)腺病毒科相关病毒载体180

(三)疱疹病毒载体180

(四)嵌合(杂合)病毒载体181

第四节报告基因的应用181

一、报告基因及其应用范围181

（一）报告基因181

（二）报告基因的应用182

二、常见的几种报告基因及其应用183

（一）荧光素酶183

（二）绿色荧光蛋白184

(三)氯霉素乙酰转移酶(cat)187

（四）β半乳糖酶187

（五）分泌型的碱性磷酸酶(SEAP)188

（六）人生长激素(hGH)188

（七）β葡糖醛酸酶(GUS)189

第七章蛋白质表达技术190

第一节外源基因在原核细胞中的表达190

一、大肠杆菌表达系统190

（一）大肠杆菌表达载体的表达元件190

（二）大肠杆菌的表达载体194

（三）外源基因在大肠杆菌中表达197

（四）提高外源基因表达水平的措施199

（五）包含体200

二、芽孢杆菌表达系统201

（一）芽孢杆菌基因表达的特点201

（二）芽孢杆菌表达系统202

（三）存在的问题203

三、链霉菌表达系统204

（一）链霉菌的生物学特征204

（二）链霉菌基因表达的特点205

（三）链霉菌基因表达系统206

（四）影响链霉菌中基因表达的因素208

（五）链霉菌表达系统的优缺点209

第二节外源基因在真核生物中的表达209

一、酵母表达系统209

（一）酵母表达系统的组成210

（二）酵母表达系统的应用策略213

二、昆虫表达系统216

（一）杆状病毒表达系统216

（二）家蚕核型多角体病毒（BmNPV）表达系统220

第三节哺乳纲细胞表达系统220

一、哺乳动物细胞表达系统的构成221

（一）宿主细胞221

（二）表达载体222

（三）目的基因225

二、常用的细胞表达系统225

三、基因的导入方法226

四、外源基因在哺乳细胞的表达和基因表达产物的检测226

五、哺乳动物细胞表达系统的改进策略226

（一）改进表达载体，提高表达水平226

（二）改造宿主细胞及培养手段228

（三）提高产品质量229

（四）筛选高表达细胞克隆的新方法230

第四节重组蛋白的检测与鉴定230

一、定量分析230

二、纯度分析230

三、重组蛋白质的鉴定231

第八章分子标记技术233

第一节概述233

一、放射性同位素233

（一）放射性同位素的基本性质233

（二）放射性强度及其度量单位234

（三）射线与物质的相互作用234

（四）射线的防护234

二、放射性同位素标记235

三、非同位素标记236

（一）发光信号的特点236

（二）化学发光的本质237

（三）生物发光237

（四）荧光的基础237

第二节核酸的标记238

一、放射性同位素标记探针238

（一）切口平移法238

（二）末端标记法240

（三）随机引物法标记脱氧核糖核酸片段243

（四）聚合酶链反应标记高活性DNA探针244

二、非放射性同位素标记244

（一）间接非同位素标记245

（二）用生物素、地高辛或荧光素标记探针的方法245

（三）DIG标记实例248

（四）直接非同位素标记249

第三节蛋白质的标记250

一、荧光标记250

（一）利用氨基的标记方法250

（二）利用基的标记方法252

（三）利用醇羟基的标记方法253

二、利用酶、酶的底物及酶抑制剂的标记253

（一）糖苷酶及其底物254

（二）磷酸酶类及其底物254

（三）其他酶与底物255

（四）生物素与亲和素系统255

三、利用抗体的标记技术256

（一）免疫荧光标记技术256

（二）放射免疫标记技术257

（三）酶免疫标记技术258

（四）胶体金标记技术258

（五）发光免疫标记技术259

第九章分子改造技术261

第一节概述261

第二节蛋白质的体外改造262

一、寡聚核苷酸指导的诱变方法262

（一）非PCR的诱变方法263

（二）PCR方法 263

（三）诱变寡核苷酸的设计265

二、随机诱变266

（一）化学诱变266

（二）丙氨酸扫描诱变267

三、突变体筛选方法267

（一）限制酶切割区分亲本模板与突变产物268

（二）单一限制位点的消除268

四、分子进化268

（一）概念268

（二）基本方法269

第三节蛋白质改造技术的应用271

一、点突变271

二、结构域改组271

三、全蛋白的重组272

四、蛋白质配体相互作用272

第四节单克隆抗体的改造273

一、抗体的产生和抗体的结构274

二、多抗、单抗及重组抗体275

三、抗体改造276

（一）人鼠嵌合抗体276

（二）小分子抗体277

（三）双功能抗体277

（四）抗体融合蛋白278

第十章测序及人工合成技术279

第一节脱氧核糖核酸序列测定279

一、Sanger双脱氧链终止法279

（一）Sanger双脱氧链终止法的原理279

（二）Sanger双脱氧链终止法所需关键试剂280

（三）用于测序的变性凝胶电泳282

（四）大片段DNA的测序策略282

二、MaxamGilbert化学修饰法283

（一）化学裂解法测序的原理283

（二）化学试剂特异断裂DNA的机制284

三、DNA序列的自动测序284

第二节DNA的化学合成285

一、脱氧核糖核酸化学合成的原理286

（一）磷酸三法合成寡核苷酸的原理286

（二）固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸的原理286

（三）用寡聚核苷酸片段组装基因的方式288

二、DNA合成技术在分子生物学研究中的应用289

第三节蛋白质和多肽的氨基酸序列测定291

一、序列测定前的准备291

（一）蛋白质纯化291

（二）肽链的分离292

（三）肽链的部分裂解292

（四）肽片段的分离293

二、序列测定的方法和原理294

（一）手工测序294

（二）自动序列分析297

三、影响测序的因素298

第四节蛋白质或多肽的化学合成298

一、氨基酸官能团的保护299

二、羧基的活化和肽键的生成301

三、合成肽的脱保护基及纯化302

第十一章基因组学技术305

第一节结构基因组学及常用研究技术305

一、基因组作图305

二、新基因的分离——cDNA末端快速扩增（RACE）技术307

三、基因组序列测定技术310

四、基因定位技术311

（一）荧光原位杂交（FISH）技术311

（二）辐射杂种细胞系（RH）技术312

第二节功能基因组学及常用研究技术312

一、基因突变检测（分析）技术313

（一）单链构象多态性（SSCP）技术313

（二）变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术315

（三）直接测序法317

（四）单碱基延伸标签阵列技术( SBETAGS)318

（五）异源双链分析技术318

（六）连接酶链反应318

（七）等位基因特异性寡聚核苷酸杂交（ASOH）318

（八）核糖核酸酶A切割法319

（九）基于PCR与酶切的技术319

（十）高通量检测技术320

二、比较基因组杂交技术321

三、微阵列比较基因组杂交技术323

四、染色体原位杂交325

五、基因表达分析技术325

（一）基因表达系列分析技术（SAGE）326

(二)RNase保护试验(RPA)328

六、模式生物体研究328

（一）转基因动物329

（二）基因打靶技术334

（三）时空可调节性基因打靶技术337

（四）基因陷阱338

（五）诱变技术在功能基因组学中的应用341

七、SNP、EST在研究新（未知）基因中的应用341

（一）单核苷酸多态性（SNP）341

（二）表达序列标签(EST)343

第十二章蛋白质组学技术345

第一节概述345

一、蛋白质组学研究的意义和背景345

二、蛋白质组学研究的特点346

第二节蛋白质组学研究的技术体系与路线350

一、蛋白质组分离技术350

（一）双向凝胶电泳的特点350

（二）双向凝胶电泳的基本步骤351

（三）蛋白质组分离的非凝胶技术356

二、蛋白质组分析技术358

三、蛋白质组数据库的建立和生物信息学学359

四、蛋白质组研究的发展趋势及应用前景359

第三节蛋白质组学技术平台与完整解决方案360

一、蛋白质组学技术平台360

二、蛋白质组学研究的完整解决方案361

第十三章生物芯片技术364

第一节概述364

一、生物芯片的概念和特点364

二、生物芯片的分类365

第二节基因芯片366

一、基本原理366

二、基因芯片的制备和检测366

（一）芯片载体的表面修饰366

（二）芯片阵列制作方式367

（三）杂交探针的种类与制备368

（四）样品制备和标记370

（五）杂交370

（六）杂交信号采集和处理371

（七）生物信息的分析和提取371

第三节蛋白质芯片373

一、基本原理374

二、蛋白质芯片制备和检测的基本流程377

（一）蛋白质芯片制备与检测流程377

（二）待检样品的制备和标记379

（三）蛋白质芯片的杂交反应和结果检测380

三、蛋白质芯片的研究进展381

（一）方法学研究和新技术的应用381

（二）抗体芯片382

第四节生物芯片在医学中的应用382

一、基因芯片在医学中的应用382

（一）微缩实验室芯片382

（二）基因突变分析383

（三）克隆选择及文库筛选383

（四）测序芯片384

（五）基因多态性分析384

（六）基因表达谱分析384

（七）微生物菌种鉴定、致病机理及耐药性分析385

（八）药物筛选芯片385

二、蛋白质芯片在医学中的应用385

（一）蛋白质组基因组链接385

（二）高通量的蛋白质表达筛选及药物研究386

（三）蛋白质和蛋白质之间相互作用的研究386

（四）在疾病诊断方面的应用388

（五）展望388

第十四章生物信息学技术390

第一节概述390

一、生物信息学的诞生和发展390

二、生物信息学研究的基本方法390

三、生物信息学的目的意义391

第二节常用核酸序列数据库392

第三节常用蛋白质序列数据库398

第四节序列分析402

一、序列比对方法和相似性搜索403

二、FASTA404

三、BLAST405

第五节蛋白质结构预测410

一、二级结构和折叠类型410

二、三级结构预测411

第十五章核糖核酸研究技术414

第一节RNA结构分析和合成分析414

一、用单链DNA探针和S1核酸酶分析mRNA414

二、核糖核酸酶保护测定419

三、引物延伸法422

四、RNA runon分析424

第二节RNA组学技术425

一、反义核酸技术426

（一）反义RNA作用机制426

（二）反义RNA 技术方法427

（三）反义RNA技术应用428

二、RNA干扰（RNAi）技术428

（一）RNAi作用的机制429

（二）RNAi实验方案430

（三）RNAi敏感性的预测432

（四）siRNA导入宿主细胞433

（五）结果分析434

（六）RNAi在基因功能分析中的应用434

第三节核酶技术434

第四节核糖核酸错折叠（ODMiR）技术436

附录438

参考文献451