实时荧光定量PCR （Quantitative Real-时间 PCR）是一种在脱氧核糖核酸扩增反应中，以荧光物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入脱氧核糖核酸双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条脱氧核糖核酸链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

技术原理

将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温退火，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补联会的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Ct 值

Ct值（Cycle threshold，循环阈值）的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。

1. 荧光阈值（threshold）的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10*SDcycle 3-15

2. Ct值与起始模板的关系

每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，公式如下。

Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)

n为扩增反应的循环次数，X0为初始模板量，Ex为扩增效率，N为荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。

起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光物质

实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：

1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

2. SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入脱氧核糖核酸双链后，SYBR仅与双链DNA进行结合，因此可以通过溶解曲线，确定PCR反应是否特异。

3. 分子信标：是一种在5和3末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡聚核苷酸探针，两端的核酸序列互补联会，导致荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，不会产生荧光。PCR产物生成后，退火过程中，分子信标中间部分与特定DNA序列配对，荧光基因与淬灭基因分离产生荧光  。

传统定量PCR

1．传统定量PCR方法简介

（1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不用标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。

（2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。

（3）PCR－ELISA法：利用地高辛或维生素H等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

2．内标在传统定量中的作用

由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。

3．内标对定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定智能能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

（1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性最好的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。

实时荧光定量PCR的定量方法

在Real-timePCR中，模板定量有两种策略，相对定量和绝对定量。

临床疾病诊断

各型肝炎、艾滋病、禽流行性感冒、结核病、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。

动物疾病检测

禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽杆菌。

食品安全

食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。

科学研究

医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。

应用行业

各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。

由于qPCR是实时定量检测致病病原体基因核酸，因此它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

根据MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-时间 PCR Experiments）  的指导方针，qPCR为Quantitative real-time PCR的简称，RT-qPCR指的是Reverse transcription–qPCR，RT-PCR仅用来表示Reverse transcription polymerase chain reaction，而不是Real-time PCR，但是有少数作者并没有坚持这一原则。

2013年春季，中国内地发生多起H7N9禽流感染人人类事件，截至4月6日下午五时，全国共报告18例人类感染，6人死亡。针对此次禽流感事件，对送检样本进行H7N9检测的方法共有两种，一种是进行核酸检测，即采用实时荧光定量PCR方法对H7N9的特异性核酸进行检测；另一种一种就是对样本进行H7N9病毒分离鉴定，直接获取毒株。“核酸检测快速准确，是现在实验室采用的主要检验方法。”专家说，H7N9特异性核酸检验耗时短，从完成样本处理到最后获取检测结果，进行确诊，整个过程在3-5个小时内完成，可实现对病毒的快速诊断。

检测过程分为三个步骤：对医院采集样本进行标本处理，如果发现可疑病例，将由当地医院专业的医护人员进行采样，主要提取患者的咽拭子样本或含漱液、鼻拭子、肺部清洗液的样本，安全保存后送至实验室开展病毒检测；提取病毒核酸，随后与H7N9核酸检测试剂配成反应体系，因为检测试剂主要针对H7N9的特异性核酸片段会起反应。可以说，通过这个试剂能快速确定病人是否感染了H7N9禽流感病毒；放入荧光定量PCR仪做病毒核酸特异扩增，进行荧光定量检测，最后结果进行检测分析，判断是否呈阳性反应。

浙江省公共卫生检验检测重点学科群首席专家、应急监测关键技术重点实验室主任卢亦愚教授，介绍了浙江省自行合成H7N9禽流感检测试剂：

“H7N9禽流感检测试剂被放置在食指大小的密封透明试管里。每套检测试剂由6份EP管组成，包含白色的水滴形小管‘引物’，以及棕色小管‘探针’。引物和探针主要是针对H7N9特异性核酸片段。目前这些试剂被放在专用试剂盒中，放置在专用冰箱保存。”

“工作人员需要将检测的结果，结合实验时设置的阳性、阴性对照进行分析，只有阴性、阳性结果成立，且样本结果可靠时才能够最终确定是否为H7N9禽流感病毒，一般来说，检测时间需3-4个小时。”