细胞工程（cell engineering）是生物工程的一个重要方面，是一门在细胞水平上进行操作的复杂生物技术。指应用细胞生物学、遗传学和分子生物学的理论和方法，按照人们预先的设计，在细胞水平上进行的遗传操作以及随后的大规模细胞和组织培养，目的是通过有计划地改变或创造细胞的遗传学性状，以获得细胞产品或利用细胞本身，改良生物品种和创造新生物。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、胚胎移植及细胞核移植与克隆等方面。

随着21世纪合成生物学的发展，通过采用计算机辅助设计、脱氧核糖核酸或基因合成技术，人工设计细胞的信号传导与基因表达调控网络，乃至整个基因组与细胞的人工设计与合成，刷新了细胞工程的技术。

细胞工程(Cell engineering)：是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。

具体是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

广义的细胞工程包括利用离体培养细胞的特性，生产有价值的生物品，或快速繁殖珍贵的植株。

对细胞的遗传操作可以在细胞结构的不同层次上进行。将体外重组的基因导入细胞，实际上是与基因工程交叉的领域（重组脱氧核糖核酸技术）。除此以外，按遗传操作对象的结构层次，细胞工程可分为4个方面：染色体工程、染色体组织工程、细胞质工程、细胞融合工程。

将一种生物的特定染色体，按照人们的意图予以消除、添加、或同别的生物的染色体置换、或改造的技术。目前基因工程的操作技术多限于单个或少数基因在大肠杆菌等微生物中的表达。为了改变真核生物的遗传性和控制高等生物的生命活动，还必须研究和开发染色体工程，建立一种新的技术体系，把所需的基因或染色体片段整合到染色体的任意位置，并能将有关遗传信息在细胞分裂中一代又一代的传递下去。目前这方面的工作还处于起步阶段。

动物染色体工程具体方法及应用

植物细胞染色体工程具体方法及应用

现在，应用染色体工程的方法，在许多添加和替代染色体工作中，已经获得了不少有遗传学和育种学价值的品系。例如，获得了添加单个冰草染色体的小麦品系中间，有的能抗粉露菌病、秆锈和叶锈。这种抗性均呈现显性单因子遗传。将黑麦第Ⅲ对染色体加到软粒小麦对粉露菌病有抗性。用冰草的一个染色体替代软粒小麦染色体3D，使软粒小麦对秆锈有抗性。这些在生产实践上都有实用价值。

诱导增加或减少一个生物体内整套染色体组数的技术。增加同种染色体组数的叫同源多倍体；增加异种染色体组数的叫异源多倍体，异源多倍体必须经过杂交才能得到(图2)（见染色体倍性）。

染色体组工程的方法多倍体的诱发，自1937年发现了用秋水仙碱诱发多倍体的方法以来，一般常用药剂（秋水仙素、富民隆等），也可用高温处理来诱发多倍体。其法是把植物的种子或幼芽浸在0.05～0.2％的秋水仙素水溶液中，处理24～96小时即可得到很好的效果。例如四倍体西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法获得的(图2）。

现在，由于原生质体分离技术的发展，也可从原生质体的融合得到多倍体。例如用聚乙二醇作诱导融合剂处理胡萝卜原生质体后，得到了频率相当高的四倍体和六倍体植株。这是来源于二个或三个原生质体融合的结果。

单倍体的诱发，60年代以来，子房、花药或花粉离体培养成功很容易从大孢子、卵细胞或小孢子等得到单倍体植株。其法是将一定时期的花药或子房移植到特定的培养基上培养。待生长愈伤组织或胚状体后，再移到分化培养基上，分化出苗和根，长成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中继续栽培到开花。单倍体植物一般不能结实或仅结少量种子。

此外，还可用远缘杂交,X射线或紫外线照射，化学药品如青鲜素、甲苯胺蓝、氯霉素等以及异源胞质等方法都能诱导单倍体产生。1970年有人又用大麦与球茎大麦杂交后染色体消除的方法，产生高频率的单倍体，有的可高达68.5％。在杂交后，球茎大麦的7个染色体就消除在胚中，留下的是大麦的7个染色体，成为单倍体的胚及小植株。经秋水仙碱处理后，染色体加倍形成纯合二倍体。

染色体组工程的应用

诱导多倍体在植物育种上的应用是有限度的。由于作物类型不同，对多倍性诱变反应也不同。原来的倍性水平、染色体组的结构、繁殖方式、多年生性、植株实用部位，所有这些都关系到育种的成败。最适宜用染色体加倍方法改良的作物应该具有：①染色体数目较少，②以收获营养体为主，③异花授粉，④多年生和营养繁殖的习性等条件。这些都是多倍体育种获得成功的先决条件。

细胞质工程研究真核生物的核、质相互关系以及细胞器，胞质基因的转移等细胞拆合的技术，所以又叫细胞拆合工程。主要研究内容是细胞质的置换。过去在植物上置换的方法是进行连续回交。例如，为了研究柳叶菜属的细胞质遗传，曾连续回交了二十五代，结果还不能把全部母核替代出来。现在由于核移植和原生质体的分离方法的改进，推进了这项工程的进展。

去核和核移植，动物细胞核的移植一般都用显微操作器进行。50年代初期，美国生物学家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期细胞的细胞核移植到去核的蛙卵，并能正常发育。后来，英国J.B.格登把爪蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核卵内，能发育到有生殖能力的成体。中国童第周等还成功地进行金鱼类异种、异属之间的核移植实验(见细胞分化)。70年代以来，体外培养的动物细胞的去核，是先用细胞松弛素B处理细胞，再高速离心使细胞核与细胞质分开。分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”或“小型细胞”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。去核后的胞质部分，仍由膜所包围，即为“胞质体”或“去核细胞”(图3）。秋水仙碱及其衍生物和长春新碱等也能诱发某些哺乳纲细胞排核。目前制备胞质体和核体的方法目臻完善，纯度可达99％左右。胞质体约可存活18～36小时。

植物细胞核的移植

在低等植物如单细胞伞藻，可把新鲜材料的假根切下，放在玻片上用玻棒挤压，使细胞的内含物压出在一滴适合的培养液中，反复冲洗几次，然后在显微镜下观察，一直到核周围无细胞质为止。离心分离后待用。维管植物如碧冬茄、天仙子、烟草、番茄等原生质体核的分离，可先在悬浮的原生质体中用蒸馏水将悬液冲淡一半，约30分钟后，原生质体破裂，放出细胞核与叶绿体，就可在0.6M蔗糖液中离心和收集核，然后存放在一定的培养液中待用。1978年以来又借用动物细胞去核的药剂细胞松弛素B来处理原生质体，加上高速离心，使原生质体分离成二部分，即：无核原生质体和小原生质体。开辟了去植物细胞核甚至去部分染色体的新途径。

细胞重组

已经分离的核体（小细胞）与胞质体在融合因子的介导下重新融合，构成“重组细胞”，这一技术即称为细胞重组，胞质体与另一完整细胞融合，即产生“胞质杂种”细胞。这两种细胞产生的效果是不同的，现在有方法把它们鉴别开。以大鼠二种成肌细胞为材料，一种是正常的具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT+)基因，另一种是突变体缺少这种基因(HGPRT-)，因此，前者细胞中有转移酶能被-次黄嘌呤标记，而后者没有这种酶，便不能标记。在两者的细胞质中让HGPRT+摄取小乳胶颗粒，让HGPRT-摄取大乳胶颗粒，以颗粒的大小来作标记。当核体（小型细胞）与胞质体融合后，在重组细胞中可看到核被氚-次黄嘌呤所标记，在细胞质中有大量大乳胶颗粒和极少数小乳胶颗粒。当胞质体与另一个HGPRT+完整细胞融合后的胞质杂种细胞的细胞质中，则同时出现有大量的大、小乳胶颗粒。如图4所示。应用这种方法很容易把两类细胞鉴别出来。

在植物中，原生质体与核的融合以烟草、矮牵牛的核移植为例，其步骤是：①先使矮牵牛游离核与烟草原生质体各自悬浮并沉淀在0.25M硝酸钙溶液中,pH6；②去掉上清液，再把它们悬浮起来，以适当比例使核与原生质体在试管中混合、离心，随后加入45％聚乙二醇溶液1毫升使之聚合：③30分钟后，徐徐加入4毫升0.2M硝酸钙(被pH9的甘氨酸氢氧化钠所缓冲)以诱导融合摄取核；④15分钟后加0.2M硝酸钙(pH6);⑤再过20分钟，原生质体用培养液冲洗；⑥镜检后，将具有双核的（其中一个是矮牵牛的核）烟草原生质体进行培养。

细胞质工程的应用

动物方面，1974年有人用两种小鼠成纤维细胞，其一用L细胞的完整细胞，它的核内具有对5-溴脱氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但细胞质内没有抗氯霉素的胞质基因，用的另一个细胞的线粒体上带有抗氯霉素的胞质基因CA(PR)，而细胞核内带有硫代鸟嘌呤敏感核基因(TGS),把后者去核细胞与前者融合（图5）,则融合后的胞质杂种细胞既能抗5-溴脱氧尿苷（BUdR），又能抗氯霉素(CAP)。但如果把亲体细胞(BUdRR和TGS)同时培养在含有这两种药物的培养基上，则都将死去。因为这两种细胞一个对CAP敏感，另一个不抗BUdR,而胞质杂种细胞则两者都能抗，不但能存活而且还能增殖。植物方面，用等渗密度梯度高速离心后，也可得到两种亚原生质体，①在低密度范围内可得到胞质体（去核原生质体）；②在高密度中，可得到小原生质体（核质体）。现在已能自玉米、烟草和胡萝卜细胞得到这两种亚原生质体。生化实验证明：去核原生质体代谢作用很低，而小原生质体由于减少了表面积和体积（仅及原生质体的10～15％），因此，摄取物质快，合成蛋白质也快，培养时发育迅速，是一种研究核质关系的好材料。由于这项工作才开始，迄今尚无明显结果。

细胞融合是指用自然或人工的方法，使两个或几个不同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞融合的结果，一个细胞中含有两个不同的细胞核，则称为异核体；随后的有丝分裂中，来自不同细胞核的染色体可能合并到一个结合核内。因此，又称为体细胞杂交。细胞融合的范围很广，从种内、种间、属间、科间一直到动、植物两界之间都进行了尝试。在植物方面，由于各类细胞具有全能性，在烟草、碧冬茄、胡萝卜等种间杂种，马铃薯和番茄、曼陀罗和颠茄、烟草和矮牵牛等属间杂种都已获得了再生植株。在动物方面人和鼠体细胞杂交，虽然不能长成一个新个体，但能作基因定位的材料。因此，这项新技术，在理论研究和工、农、医方面的应用，均有广阔的前景。细胞融合技术的发展，历史很短。自1960年在体外培养中发现杂种细胞以来，仅20多年。1965年冈田善雄等和H.哈里斯等各自用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间异核体。1970年已应用人与鼠的细胞杂交系统地进行了人类染色体基因的定位工作。在植物方面，1960年ec科金首先使用纤维素酶分离番茄幼根的原生质体获得成功。1970年他们又成功地使种间原生质体融合在一起。1972年P.S.卡尔森等又从融合的原生质体获得了第一株种间细胞杂种。到1980年为止，种间融合的再生植株已有16种之多。

细胞融合的方法

动物细胞杂交或细胞融合，将两个不同种的亲本细胞A和B，以灭活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)为融合诱导剂，使A和B两细胞融合成为一个具两个遗传性不同核的异核体（如遗传性相同的核融合在一起叫同核体）。随后异核体经有丝分裂成为两个具有A和B两亲本的杂种融合核。AB杂种经多次分裂，B亲本的染色体会逐渐减少到一个或完全消失(图6)。

植物体细胞杂交①原生质体的分离。植物细胞之间有果胶质粘连，每个细胞之外还有一层纤维素组成的壁，因此，在分离原生质体时，首先要在一定浓度的酶液(果胶酶与纤维素酶)中保温，消去果胶质与纤维素后才能使原生质体分离出来。②原生质体的融合。不同种之间原生质体的融合，须选用一种融合诱导剂(聚乙二醇，或高钙氯化钙2O,0.05M溶于甘露醇0.4M和pH10.5)诱导融合。它们的诱导率可达20～50％。③杂种细胞的选择与培养。细胞融合后要把杂种细胞选择出来。一般都利用各种生化指标和遗传标记来选择和鉴定。例如，使用天然的或人工诱变的突变体，如白化苗、营养缺陷型、抗药性突变体等，或根据不同材料对激素敏感性不同，生长差异等，来设计适合的选择系统。如果融合的原生质体一个是白化病，另一个具叶绿体,就可用机械的方法，把融合的细胞在倒置显微镜下把它们挑选出来进行培养。这些细胞培养到各个发育阶段，如愈伤组织、分化苗和根，都需要更换培养基，才能使它们顺利地再生成植株。

细胞工程作为科学研究的一种手段，已经渗入到生物工程的各个方面，成为必不可少的配套技术。在农林、园艺和医学等领域中，细胞工程正在为人类做出巨大的贡献。

利用细胞工程技术进行作物育种，是迄今人类受益最多的一个方面。我国在这一领域已达到世界先进水平，以花药单倍体育种途径，培育出的水稻品种或品系有近百个，小麦有30个左右。其中河南省农科院培育的小麦新品种，具有抗倒伏、抗锈病、抗白粉病等优良性状。

在常规的杂交育种中，育成一个新品种一般需要8～10年，而用细胞工程技术对杂种的花药进行离体培养，可大大缩短育种周期，一般提前2～3年，而且有利优良性状的筛选。前面已介绍过的微繁殖技术，在农业生产上也有广泛的用途，其技术比较成熟，并已取得较大的经济效益。例如，我国已解决了马铃薯的退化问题，日本麒麟公司已能在1000升容器中大量培养无病毒微型马铃薯块茎作为种薯，实现种薯生产的自动化。通过植物体细胞的遗传变异，筛选各种有经济意义的突变体，为创造种质资源和新品种的选育发挥了作用。现已选育出优质的番茄、抗寒的亚麻、以及水稻、小麦、玉米等新品系。有希望通过这一技术改良作物的品质，使它更适合人类的营养需求。

蔬菜是人类膳食中不可缺少的成分，它为人体提供必需的维生素、矿物质等。蔬菜通常以种子、块根、块茎、插或分根等传统方式进行繁殖，化费成本低。但是，在引种与繁育、品种的种性提纯与复壮、育种过程的某些中间环节，植物细胞工程技术仍大有作为。例如，从国外引进蔬菜新品种，最初往往只有几粒种子或很少量的块根、块茎等。要进行大规模的种植，必须先大量增殖，这就可应用微繁殖技术，在较短时间内迅速扩大群体。在常规育种过程中，也可应用原生质体或单倍体培养技术，快速繁殖后代，简化制种程序。另外，还可结合植物基因工程技术，改良蔬菜品种。

在果树、林木生产实践中应用细胞工程技术主要是微繁殖和去病毒技术。几乎所有的果树都患有病毒病，而且多是通过营养体繁殖代代相传的。用去病毒试管苗技术，可以有效地防止病毒病的侵害，恢复种性并加速繁殖速度。目前，香蕉、柑橘、山楂、葡萄、桃、梨、荔枝、龙眼、核桃等十余种果树的试管苗去病毒技术，已基本成熟。香蕉去病毒试管苗的微繁殖技术已成为产业化商品化的先例之一。因为香蕉是三倍体植物，必须通过无性繁殖延续后代，传统方法一般采用芽繁殖，感病严重，繁殖率低；而采用去病毒的微繁殖技术不仅改进了品质，亩产量约提高30％～50％，很容易被蕉农接受。近年来，对经济林木组织培养技术的研究也受到很大的重视。采用这一技术可比常规方法提前数年进行大面积种植。特别是有些林木的种子休眠期很长，常规育种十分费时。据不完全统计，现已研究成功的林木植物试管苗已达百余种，如松属、桉树属、杨属中的许多种，还有泡桐、槐树、银杏、茶、棕榈、咖啡、椰子树等。其中桉树、杨树和花旗松等大面积应用于生产，澳大利亚已实现桉树试管苗造林，用幼芽培养每年可繁殖40万株。

植物细胞工程技术使现代花卉生产发生了革命性的变化。1960年，科学家首次利用微繁殖技术将兰花的愈伤组织培养成植株后，很快形成了以组织培养技术为基础的工业化生产体系——兰花工业。现在，世界兰花市场上有150多种产品，其中大部分都是用快速微繁殖技术得到的试管苗。从此，市场供应摆脱了气候、地理和自然灾害等因素的限制。至今，已报道的花卉试管苗有360余种。已投入商业化生产的有几十种。我国对香石竹、月季、唐昌蒲、菊花、非洲紫罗兰等品种的研究较为成熟，有的也已商品化，并有大量产品销往港澳及东南亚地区。

自1975年英国剑桥大学的科学家利用动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，许多人类无能为力的病毒性疾病遇到了克星。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且诊断异常准确，误诊率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的单克隆抗体，其灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍，能检测出抗血清的60％的假阴性。

近年来，应用单克隆抗体可以检查出某些还尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积，这为有效的治疗提供方便。单克隆抗体并已成功地应用于临床治疗，主要是针对一些还没有特效药的病毒性疾病，尤其适用于抵抗力差的儿童。人们正在研究“生物导弹”——单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。

单克隆抗体可以精确地检测排卵期。新一代免疫避孕药也在研制之中，其基本原理是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。人类体外受精技术的日趋成熟，使人类对生育活动有了较大的选择余地，促进优生优育，提高人口素质，也为不孕症患者或不宜生育的人带来福音。

生物药品主要有各种新型冠状病毒疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质，抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，通过培养、诱变等细胞工程或细胞融合途径，不仅大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可以同时抵御两种以上的病原菌的侵害。用同样的手段，也可培养出能在培养条件下长期生长、分裂并能分泌某种激素的细胞系。1982年美国科学家用诱变和细胞杂交手段，获得了可以持续分泌干扰素的体外培养细胞系，现已走向应用。

目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。精液和胚胎的液氮超低温（-196摄氏度）保存技术的综合使用，使优良公畜、禽的交配数与交配范围大为扩展，并且突破了动物交配的季节限制。另外，可以从优良母畜或公畜中分离出卵细胞与精子，在体外受精，然后再将人工控制的新型受精卵种植到种质较差的母畜子宫内，繁殖优良新个体。综合利用各项技术，如胚胎分割技术、核移植细胞融合技术、显微操作技术等，在细胞水平改造卵细胞，有可能创造出高产奶牛、瘦肉型猪等新品种。特别是干细胞的建立，更展现了美好的前景。

动植物细胞与组织培养

细胞融合（新的物种或品系、单克隆抗体）

细胞核移植（无性繁殖、克隆动物）

染色体工程（多倍体育种，例：八倍体黑小麦）

胚胎工程（优良品种、试管婴儿）

干细胞与组织工程（胚胎干细胞、组织干细胞）

转基因生物与生物反应器（转基因动物、转基因植物）

细胞的发现

1665年，英国人罗伯特·胡克（Hooke）利用自己设计的显微镜第一次观察到了细胞。

细胞理论的提出

1838年，施莱登（Schleiden）发表“植物发生论”，认为无论怎样复杂的植物都由细胞构成。

1839年，施旺（Schwann）发表“关于动植物结构和生长一致性的显微研究”。提出“细胞学说”（Cell Theory)。之后，德国科学家鲁道夫·菲尔绍（Virchow）补充了细胞学说，认为所有的细胞都来自于已有的细胞分裂。细胞学说的建立揭示了生物界的统一性和生命的共同起源，是19世纪自然科学的三大发现之一。

细胞与组织培养

1902，Haberlandt，植物细胞全能学说。

1907，Harrison，蛙胚神经细胞突起，无菌操作技术。

1912，Carrel，鸡胚心肌组织块长期传代培养。

1940，Earle，首创单个细胞克隆培养，建立小鼠结缔组织

L细胞系，并在1951年开发了人工培养液。

细胞融合

1975，Cesar Milstein与Geoger Kohler合作，羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，得到既能体外无限繁殖又能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。

胚胎工程

1978年，英国剑桥大学生理学家罗伯特·爱德华采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿路易丝·布朗。

转基因生物

1983年Palmiter和Brins ter将大鼠生长激素基因转入小鼠，生产出生长速度极快的硕鼠。

1987年Gordon获得分泌组织纤溶酶原激活因子tPA的转基因小鼠。

细胞核移植

1938年，德国胚胎学家Spemann提出胚胎细胞核移植到去核卵母细胞中可发育为新胚胎。

1997年，“多莉”羊的诞生标志着哺乳纲的体细胞核克隆时代到来。

书名：细胞工程

作者：潘求真

出版社：哈尔滨工程大学出版社

出版时间：2009-7-1

ISBN:9787811334883

开本：16开

定价：45.00元

内容简介

细胞工程是细胞水平的生物技术，也是该领域中最先应用于生产实践并取得显著效益的应用学科。本书较全面、系统地介绍了细胞工程的基本原理、基本技术及其应用以及学科的最新研究成果。全书共分细胞工程学基础、植物细胞工程、动物细胞工程、微生物细胞工程和组织细胞工程等共二十章。各章在全面总结已有研究成果的基础上，着重对其在农业、医药、食品、环境等领域的应用状况和原理进行全面的介绍。每章后面附有思考题以便于学生复习掌握。

本书可用作综合院校、师范院校以及农林院校生物技术、生物工程及其他生命科学专业的细胞工程课程的教材，也可供其他院校有关专业的相关课程选用，同时也适用于生物及医学研究人员阅读参考使用。

图书目录

第一编 细胞工程基础

第二章 细胞工程实验室及基本技术

第二编 植物细胞工程

第三章 植物细胞工程的基本原理

第四章 植物组织培养与器官培养

第五章植物细胞培养第六章 植物原生质体培养和细胞融合

第七章人工种子

第八章 植物离体培养下的遗传变异与种质离体保存

第九章 细胞工程的细胞学基础

第十章动物细胞培养的基本条件

第十一章动物细胞培养技术

第十二章 细胞融合

第十三章 染色体工程

第十四章 胚胎工程

第十五章 克隆动物

第十六章转基因动物

第十七章 干细胞技术

第十八章 组织工程

第十九章 细胞工程的应用

第二十章 微生物细胞工程

附录

参考文献